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血培养操作指南
 
     当微生物侵入血液迅速繁殖超出机体免疫系统清除这些微生物的能力时形成菌血症或真菌血症(统称血流感染),并可感染血管外组织,属临床医学急症,应尽快采集血液进行培养。资料显示,菌血症或真菌血症发病率近10年来持续增加,2007年美国共报告菌血症发生66万例[1],在各种感染中居首位,且死亡率高(20%~50%)。血培养是采集患者血液标本并接种到培养瓶中,用以发现、识别引起菌血症或真菌血症的病原微生物,是诊断菌血症和真菌血症的基本而重要的方法。血培养结果对感染性疾病的诊断、治疗和预后都有极为重要的临床意义。
    1.标本的采集和运送
    1.1 总体要求
    1.1.1 血培养的临床指征:
    患者出现以下一种或同时具备几种临床表现时可作为血培养的重要指征:①发热(≥38 ℃)或低温(≤36 ℃),以间歇驰张型多见,革兰阴性杆菌,如大肠埃希菌引起的感染可见双峰热;②寒战;③白细胞增多(>10.0×109/ L,特别是有“核左移”时);④粒细胞减少(<1.0 ×109/ L);⑤血小板减少;⑥皮肤、黏膜出血,常见于溶血性链球菌感染的菌血症,伤寒病人第4~10天可出现玫瑰疹,斑疹伤寒第4~6天可出现暗红色斑丘血疹;⑦昏迷;⑧多器官衰竭;⑨血压降低;⑩呼吸加快(呼吸率>20/分或CO2分压<32mmHg);以及肝脾肿大;关节疼痛;C反应蛋白、内毒素、降钙素原升高等。
    对新生儿可疑菌血症,还应同时做尿液和脑脊液培养。
    老年菌血症患者可能不发热或体温不低,如伴有身体不适、肌痛或卒中,可能是感染性心内膜炎的重要指征。
    1.1.2 血培养的采集时机:
    只要怀疑患者有血流感染的可能,在考虑使用抗菌药物之前,都应立即采集血培养标本。若患者已行抗菌药物治疗,则应选择含有抗菌药物吸附物的培养瓶,并在下一次抗菌药物应用前采血培养。细菌通常在寒战和发烧前1小时入血,此时为采集血培养标本进行病原菌培养的最佳时机。
    1.1.3 血培养的次数:
    要求:对怀疑菌血症、真菌血症的成人患者,推荐同时或短时间间隔(30~60分钟)从不同部位(如双臂)采集2~3套血培养标本,即“双瓶双侧”。 至少做到“双侧双瓶”。如有必要,可同时或短时间间隔内从下肢静脉采血接种第三套培养瓶。
    只有在疑似感染性心内膜炎或导管相关性感染患者的连续性菌血症时在不同时间点采血才有必要,除疑似感染性心内膜炎或导管相关性感染患者(详见3.4、3.5),在采集血培养后的2至5天内,不需要重复采集血培养。
    婴幼儿患者,需要同时采集2次(不同部位)血培养标本。
    说明:以一个需氧瓶和一个厌氧瓶为一套血培养,作为常规血培养组合。所谓“双瓶双侧”,是指从一个部位采血接种一套培养瓶,再从另一部位采血接种另一套培养瓶。所谓“双侧双瓶”,是指从一个部位采血接种一个需氧瓶,再从另一部位采血接种另一个厌氧瓶。一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视为单个血培养[2]
    研究表明[3],只做1套血培养,病原菌的检出率仅为65%,两套血培养为80%,三套血培养为96%。单瓶血培养不仅检出率不高,而且难以区分污染导致的假阳性,结果很难做出临床解释,应该坚决予以废除。
    虽然两套血培养采血时间习惯上通常间隔30~60分钟,但研究结果显示,与同时采集两套血培养结果比较,在病原微生物的检出方面不存在差异[4]
    在抗菌药物治疗开始后的2至5天内,血液中的细菌不会立即清除。一般菌血症或真菌血症的患者可通过临床表现来判断疗效,无需复查血培养或者连续监测血培养。但有两个例外:一是细菌性心内膜炎患者,对于其菌血症或真菌血症是否被清除,连续血培养可被用于评估和指导治疗;二是与感染性心内膜炎无关的金黄色葡萄球菌血症,对其阳性血培养的48至96小时追踪可以很好地预测复杂的金黄色葡萄球菌血症[5]
    1.1.4 血培养的采血量:
    要求:成年患者推荐的采血量为20~30ml, 每套不少于10ml,每瓶不少于5ml。婴幼儿患者推荐的采血量应少于患儿总血容量的1%,每瓶不少于2ml。对于采用成品血培养瓶的实验室,必须按照血培养瓶生产厂家的建议,采集足够的血液标本。
    说明:血培养采血量是影响病原菌检出率的最重要的可变因素[3,4,6,7]。一般情况下,成人菌血症患者外周血中细菌浓度为1~10CFU/ml,成人血培养采血量在2~30ml之间时,病原菌检出率与采血量成正比例增长[3,4,7]。血培养采血量达到或超过40ml时,检出率虽然与采血量的增加不再成正比例增长,但检出率仍会升高。儿童患者同样有数据表明检出率与血培养的采血量成正相关[8],但由于儿童患者血液中病原菌浓度较高,一般约为成人血流感染病原菌浓度的10倍,血培养标本量无需等同于成人。但是,儿童也可能发生低水平的菌血症,血培养采血量要根据患儿的血容量和年龄确定。
    1.1.5 血液标本在需氧瓶和厌氧瓶中的分配
    要求:以一个需氧瓶和一个厌氧瓶为一套血培养,作为常规血培养的组合。当采血量不够推荐的采血量时,应首先满足需氧瓶,剩余标本再接种入厌氧瓶。
    说明:采用一个需氧瓶和一个厌氧瓶的血培养组合与采用2个需氧瓶的组合相比,可检出更多的葡萄球菌、肠杆菌科细菌和厌氧菌[9]。真菌和严格的需氧菌(如假单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌)几乎全部只能从需氧瓶中分离到的。
    1.2 血培养标本的采集
    1.2.1 皮肤消毒与防止血培养污染
    要求:使用碘酊、次氯酸或洗必泰作为血培养的皮肤消毒剂,效果要优于碘伏。碘酊的作用时间不能少于30秒,碘伏的作用时间则需要1.5~2分钟。
    说明:碘酊与洗必泰的效果大体相当。洗必泰的作用时间和碘酊一样,但是没有过敏反应,因此在静脉穿刺完成后不必擦去,但不能用于小于2个月的婴儿皮肤的消毒。对年龄小于2个月的新生儿,需使用70%的异丙基乙醇进行皮肤消毒。消毒剂需要有足够的作用时间以保证消毒效果。
    1.2.2 标本采集部位
    要求:从两侧上肢静脉采血,“双瓶双侧”采血培养。至少做到“双侧双瓶”。必要时从下肢静脉采血做第三套血培养。
    说明:从动脉血或下肢静脉采血病原菌检出率并不高,且增加了抽血污染的机会。尽量避免从静脉留置导管采血培养,因其常伴有高污染率[10,11,12]。如果必须从留置导管内采血,也应同时从外周静脉采集另外一个血培养标本以帮助阳性结果的判读(参见3.4 导管相关血流感染)。
    1.2.3 减少血培养污染的注意事项
    要求:采血之前,血培养瓶的橡皮塞需使用70%异丙醇酒精消毒并干燥,然后再进行穿刺部位的皮肤消毒。严格按照1.2.1所述皮肤消毒方法操作,并等待足够消毒时间。严格无菌操作,不允许在皮肤消毒后用手接触待穿刺部位,除非带有无菌手套。不推荐采血后更换注射器针头接种血培养瓶,采用真空采血装置能降低污染率。
    说明:无论采用何种采血方法,血培养可接受的污染率通常是≤3%[13]。研究表明,经过专门培训的熟练抽血者采集血培养的污染率为3%,而未经培训的住院医生和护士污染率则达11%。因此对临床护士就血培养标本采集进行专门的、严格的培训是非常必要的。
    1.3 血培养标本的运送
    要求:采血后应该立即送检。如不能立即送检,需室温保存,切勿冷藏。 标本接种到培养瓶后,需轻轻颠倒混匀以防血液凝固。
    说明:血培养瓶在接种前、接种后均不得冷藏或冷冻,否则会导致某些病原微生物死亡。接种后的培养瓶最好立即送到实验室,最迟不能超过2小时。自动化连续监测系统虽有允许延迟上机监测微生物生长的原理,还是应该尽量减少延迟上机时间,否则可能导致检测时间延长甚至假阴性结果。
采用裂解-离心血培养技术的标本不能放置超过八小时,否则会降低某些特殊病原菌的分离率或使之生长延缓。
    1.4 血培养标本的拒收标准
    遇到下列血培养标本检验科可拒收并且要求重新采集标本:
    1.血培养瓶上贴的标签错误或未贴标签。
    2.血培养瓶渗漏、破裂或明显污染。
    3.血液凝固;
    1.5 培养基的选择
    使用商品化的血培养瓶。
    说明:使用添加抗菌药物吸附剂(如树脂或活性碳颗粒)的血培养瓶有助于提高已接受抗菌药物治疗患者血培养的检出率,特别是能提高葡萄球菌和真菌的检出率[14],但同时也会增加污染菌的检出。
    1.6 血培养的培养周期
    要求:传统手工血培养方法一般孵育7天。自动化血培养系统的标准血培养周期为5天。
    说明:对一些生长缓慢的苛养菌(如巴通体、军团菌、布鲁杆菌、奴卡菌)和双相真菌来说,传统手工血培养方法需要更长的培养时间。
    自动化血培养系统的标准血培养周期为5天,包括布鲁杆菌、流感嗜血杆菌、放线杆菌、心杆菌、侵蚀艾肯菌、金杆菌以及营养变异链球菌等的培养周期都是5天[15]。对怀疑为感染性心内膜炎患者的血培养也不必延长培养时间。5天后阴性血培养标本无需常规进行转种。有研究表明,自动化血培养系统一般能在3~4天内检出95%~97%的有临床价值的细菌和真菌,但目前仍然推荐5天的培养周期。特殊情况可适当延长培养时间。
    2. 几种特殊要求的血培养(本院检验科暂未开展)
    2.1分枝杆菌血培养
    要求:必须用特殊的商品化分枝杆菌血培养瓶。所有培养都必须孵育至少4周。培养温度为25~30℃,
    说明:虽然分枝杆菌并不是需要特别复杂营养的微生物,但是为了更好地从血标本中分离出分枝杆菌,需要在肉汤培养基中补充脂肪酸(如油酸)、白蛋白和二氧化碳。一些分枝杆菌菌种(如日内瓦分枝杆菌、嗜血分枝杆菌)还需要分枝菌素、血红素、血红蛋白或枸橼酸铁铵这样的添加剂。
    快速生长的分枝杆菌(如偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、产粘液分枝杆菌等)所致菌血症则大多与长时间留置静脉导管污染有关[16]
    2.2 婴幼儿血培养
    要求:婴幼儿血培养一般采用两只需氧瓶为一组血培养,仍然采用双侧双瓶的采血方式。采血量应少于患者总血容量的1%,每瓶不少于2ml。
    说明:由于婴幼儿患者厌氧菌所致菌血症比较罕见,婴幼儿血培养可以仅用需氧瓶[17],为提高检出率、区分污染菌,应采用两只需氧瓶为一组血培养。
    仅在未满月的新生儿、罹患慢性口腔或鼻窦感染、蜂窝织炎(特别是肛周)、腹腔感染、咬伤、静脉炎以及接受类固醇治疗的患儿考虑使用厌氧血培养瓶。
    皮肤消毒方法与成人基本一样,但新生儿皮肤消毒不能使用含碘消毒剂以免造成亚临床甲状腺功能减退。洗必泰不能用于小于2个月婴儿的皮肤消毒。对年龄小于2个月的新生儿,推荐使用70%的异丙基乙醇进行皮肤消毒。与成人一样,如果婴幼儿血培养标本是从静脉导管获得,则要同时从外周静脉抽血作血培养检测。
    从个体化考虑,婴幼儿血培养的标本量还要参考其体重、红细胞压积等参数。
    2.3导管相关的血流感染(CRBSI)
    据估计,美国每年发生超过25万例的CRBSI,病死率达12~25%。目前国内还没有相关的统计资料,但随着长期留置导管患者人数激增,CRBSI会越来越严重。CRBSI发生的危险因素包括:导管类型(中心静脉导管,外周导管)、导管放置时间及部位。虽然CRBSI发生比较频繁,但目前还缺乏诊断CRBSI的金标准,诊断往往比较困难。临床上在留置导管部位常常没有炎症表现,只有一些非特异的临床症状提示可能存在菌血症。临床微生物实验室有一些诊断此类感染的方法,比如导管片段的定量、半定量培养;经外周静脉采血和经导管采血培养结果比对;经外周静脉采血和经导管采血定量培养,比较经外周静脉采血和经导管采血培养阳性报警时间的差异等[18],但还没有明确的结论表明哪种方法最好。为避免不必要的导管拆除,可以尝试导管保留在原位的CRBSI诊断方法。正确地区分CRBSI与皮肤污染、微生物仅在导管上定植以及其他来源感染有重大临床价值。
    2.3.1 短期外周导管
    要求:通过静脉穿刺获得病人的两套外周血培养(双瓶双侧)。无菌操作拔出导管并用Maki半定量方法[19]培养。
    说明:Maki半定量法是先用75%酒精清洁导管周围皮肤,然后无菌手续移动导管,剪取导管末端5cm置于无菌容器中,立即送至实验室(为防止干燥,常规培养送检时间不得超过15min,4℃保存不得超过2小时)。实验室人员用无菌镊子将导管在血琼脂平板上交叉滚动4次,然后弃之,将接种后的培养基置CO2孵箱35℃过夜培养,平板上菌落数不少于15个为阳性。
    培养结果的解释:
    a  如果一套或多套血培养阳性,导管片段培养也是阳性(半定量≥15 个菌落),并且为同一种菌:提示导管相关血流感染(CRBSI)。
    b  如果一套或多套血培养阳性,而导管片段培养阴性:不能确定为CRBSI;但如果培养出的是金黄色葡萄球菌或假丝酵母菌,而且能排除其他来源的感染,则提示CRBSI。
    c  如果血培养阴性,而导管片段培养阳性,提示是微生物在导管表面定植而非CRBSI。
    d  如果血培养阴性,导管片段培养也是阴性,则不可能是CRBSI。
    2.3.2 中心静脉导管及静脉留置口(VAP)
    有两种方法,其中方法一适用于想保留导管的患者,如果已经决定要拔除导管,则方法二更合适。
    方法一:对疑似CRBSI的患者至少需要采集两套血培养,其中至少一套标本来自外周静脉(注意做好标记),另一套血培养标本需同时或短时间间隔内从导管口或VAP隔膜无菌操作采集(注意做好标记)。
培养结果的解释:
    a  如果两套血培养均阳性,通过菌种鉴定和药敏试验结果比对确定为同一株微生物,并且缺乏其他感染的证据,提示为CRBSI
    b  如果两套血培养均为阳性,来自导管的血培养的细菌数量(CFU/ml)是外周静脉血培养的5倍以上,并且缺乏其他感染的证据,提示可能为CRBSI(适用于手工定量血培养系统,比如裂解-离心浓缩法) 。
    c  如果仅有导管的血培养为阳性:不能确定为CRBSI,提示为导管定植菌或标本采集过程中的污染菌。
    d  如果仅有来自外周静脉的血培养为阳性,不能确定为CRBSI,但是如果培养出的微生物是金黄色葡萄球菌或假丝酵母菌,并且缺乏其他感染的证据,则提示可能为CRBSI。确定为CRBSI还需要定量或半定量导管片段培养出相同微生物。
    e  如果两套血培养均为阴性,不是CRBSI
    方法二:通过独立的外周静脉穿刺无菌采集两套血培养;拔出可疑导管,剪取5cm的导管远端的片段送实验室进行Maki’s半定量培养或振荡/超声后定量培养。
    培养结果的解释:
    a  如果一套或多套血培养阳性,同时导管末端培养阳性,而且通过菌种鉴定和药敏试验结果比对确定为同一株微生物,则很可能是CRBSI 。
    b  如果一套或多套血培养阳性,而导管末端培养为阴性,如果培养出的微生物是金黄色葡萄球菌或假丝酵母菌,并且缺乏其他感染的证据,则提示可能为CRBSI。确定为CRBSI还需其他结果支持。
    c  如果血培养阴性而导管末端培养阳性,提示为导管定植菌,不是CRBSI。
    d  如果血培养和导管末端培养均为阴性,则不会是CRBSI。
    2.4 感染性细菌性心内膜炎
    血培养结果对感染性心内膜炎的诊断和治疗非常重要。如果采用较理想的血培养技术,90%以上感染性心内膜炎患者能获得阳性血培养结果。以下为适用于感染性心内膜炎诊断的特殊规定。
    2.4.1血培养的采集时机
    a  急性感染性心内膜炎:
    要求:在经验性抗生素治疗前30min之内采血培养。
    说明:对于疑似或已知高毒力病原菌(如金黄色葡萄球菌)所致感染性心内膜炎患者,需要在第一时间立即采血培养以避免治疗上不必要的延误。
    b  亚急性感染性心内膜炎:
要求:两套血培养之间间隔30分钟到1小时。
说明:适当的时间间隔有助于证明为持续性菌血症,尤其是当心电图正常或模棱两可时具有更高的临床价值。
    对疑似亚急性感染性心内膜炎的患者,不一定必须在经验性抗生素治疗前采血培养,对这些患者,尝试确定微生物学诊断更为重要。由于大多数感染性心内膜炎患者菌血症持续存在,使血培养的时间选择相对不是那么重要。
    2.4.2 皮肤消毒
    要求:充分皮肤消毒后,通过不同部位的静脉穿刺获得血培养标本,不能通过留置导管采血培养。
    说明:对疑似感染性心内膜炎患者,采血培养时充分的皮肤消毒尤为关键,这是因为亚急性感染性心内膜炎或有人工心脏瓣膜的患者,其主要病原菌就是皮肤常见菌群,比如凝血酶阴性葡萄球菌。因此,血培养标本一定要通过静脉穿刺获得,而不能通过留置导管获得,否则将增加污染机会,并得出错误的感染性心内膜炎的结论。
    2.4.3 需要的血培养数量
    要求:先采集3套血培养。如果这些血培养在24小时内均为阴性,则需再采集2套血培养,总共需采集5套血培养。
    说明:不同患者最合适的血培养数量可以有所不同,但很清楚,只有一个血培养是一定不够的。当采集多套血培养时,皮肤菌群常能导致某个血培养阳性。多套血培养有助于临床医生和实验室从真正的阳性血培养中正确区分由于皮肤污染导致的假阳性。另外,增加血培养数量相应增加了血培养的采血量,而采血量的增加是提高血培养病原微生物分离率最重要的独立因素。单个血培养既不能证明持续性菌血症,也无助于区分污染还是真正的菌血症,并且血培养的标本量不够而导致分离率的下降。
    2.4.4 需要的培养瓶
    要求:使用成套血培养瓶(一个需氧瓶和一个厌氧瓶)。对已经接受抗菌药物治疗的患者,需使用能拮抗或中和抗菌药物抑制作用的血培养瓶(比如有活性炭颗粒或树脂颗粒的血培养瓶)。
    说明:使用成套血培养瓶能提高某些厌氧菌(比如链球菌,尤其是营养变异链球菌)的检出率。
临床上疑似感染性心内膜炎的患者经常已经接受抗菌药物治疗,这是此类患者血培养假阴性的独立的最常见的原因。为了克服这些抗菌药物对病原菌生长的抑制作用,使用能拮抗或中和这种抑制作用的血培养瓶(比如有活性炭颗粒或树脂颗粒的血培养瓶)非常必要。
    造成感染性心内膜炎“培养阴性”的另一个可能原因是由于所谓的“营养变异链球菌”(NVS)存在,它们生长需要维生素B6或半胱氨酸。目前商品化血培养瓶中都已经添加了这些物质。如果血培养瓶转种时发现有链状排列的革兰阳性球菌,符合链球菌的特征,但在羊血琼脂平板上不生长,则可能存在营养变异链球菌。据估计,5~6%的心内膜炎患者患者存在营养变异链球菌[20]
    2.4.5 血培养所需孵育时间
    要求:全自动血培养系统的孵育时间为5天。如果所有5套血培养结果均为阴性,但临床仍怀疑为感染性心内膜炎,则需从所有培养瓶中抽取培养液转种巧克力琼脂并涂片染色镜检。
    说明:对疑似感染性心内膜炎患者的血培养,全自动血培养系统的检测周期也是5天。以前曾要求对某些导致感染性心内膜炎的苛养菌至少需要孵育两周,但随着检测技术及培养基配方的持续改进已经不再需要这么长时间。2005年的研究[21]显示,对215例疑似感染性心内膜炎患者采用延长孵育时间等多种血培养方案,结果在孵育5天以后只发现3例临床相关结果,其中2例是鸟分枝杆菌混合株,另一例为嗜肺军团菌,所有HACEK细菌群的细菌均能在5天内检出。
    3. 血培养结果的报告方式
    血培养无论是阴性还是阳性结果,都对患者的诊断和治疗非常重要!尤其是血培养的阳性结果要纳入危机值报告的范畴,建立专门的危机值报告制度,详细记录包括患者信息、标本送检时间、种类及数量、系统阳性报警时间、涂片染色结果以及报告人和告知人等内容,临床科室也应有相应记录。
    建议在已建立实验室信息管理系统(LIS)的医院,应将血培养的情况及时发送到网上,让临床医生随时掌握血培养检测的进展情况。至少应包括如下内容:
    a 实验室已接到申请,但尚未收到标本
    b 标本已收到,血培养的数量及检测项目
    c 正在检测中,尚无结果
    d 24小时无生长
    e 48小时无生长
    f 系统已阳性报警,阳性报警时间及直接涂片染色镜检结果
    g 过夜培养后初步鉴定结果
    h 最终鉴定及和药敏试验结果
    本院检验科微生物室一旦系统出现阳性报警,即立即直接涂片报告染色镜检结果,次日报告初步药敏结果。
    3.1 阳性血培养的分级报告制度
    3.1.1 初步报告
    要求:血培养阳性报警后,应立即抽取培养液进行涂片、革兰染色、显微镜镜检,并将结果向临床主管医生进行紧急口头(电话)报告。有条件的要在4小时之内将数据录入LIS系统。
    说明:口头报告包含以下内容,并填写专用危机值报告登记本:
    a 患者基本信息
    b 标本种类、数量及送检时间
    c 系统阳性报警时间(可作为污染菌鉴别的因素之一)
    d 报告的时间(临床医生或者护士接到该报告的时间)
    e 革兰染色镜检结果。有经验的实验室工作人员可根据细菌染色及形态特点,在有把握的情况下,可提出倾向性报告,如疑似某种或某类细菌,以便临床能尽早针对性选择合适抗菌药物。
    f 实验室报告者全名(或工号)
    g 接听电话的临床医生或护士全名(或工号)
    3.1.2 二级报告
    要求:阳性报警的血培养转种培养基培养16~18小时后,观察培养基上菌落形态、革兰染色后菌体形态以及某些试验结果,尽可能通知临床初步鉴定结果和某些耐药特征。有条件的要在4小时之内将数据录入LIS系统。
    说明:直接药敏试验可以在有条件的医院先开展。某些试验如触酶、氧化酶、血浆凝固酶、链球菌分群、MRSA胶乳凝集、β-内酰胺酶等有助于初步鉴定菌种和确定某些菌种的特征性耐药情况。
如发生二级报告结果与初级报告不相符的情况,需仔细查找、分析原因,并尽快与临床沟通,填写临床告知单,注明变更的内容。
    3.1.3 最终(书面)报告
    要求:报告最终菌种鉴定及药敏试验结果。有条件的要在4小时之内将数据录入LIS系统。
    说明:最终报告中应包括初步报告内容。如发生最终报告结果与初级报告、二级报告不相符的情况,需仔细查找、分析原因,并尽快与临床沟通,填写临床告知单,注明变更的内容。
    3.2 其他报告和记录
    要求:标本被拒收时,需即刻通知临床立即重新采血,并记录在案。其他需临床注意的事项,如本次采血量不足、标本转运时间过长、标本采集份数不够等信息也要及时与临床沟通,并记录在案。
    4. 血培养的污染问题及其鉴别
    要求:为了将血培养污染最小化,每个实验室必须具有以下措施:
    a 注重血培养标本采集技术的培训提高,减少污染的发生;
    b 采集合适的血培养套数以便有效检出病原微生物,并能正确区分血培养污染;
    c 结合医院血培养开展状况,建立能客观、准确评估血培养阳性菌株是病原菌还是污染菌的标准化程序。
    说明:污染导致的血培养假阳性是一个较为普遍的问题,即使采用最好的血培养标本采集方法也很难将污染率降至2%以下[15]。血培养假阳性结果将导致不必要的抗生素治疗,延长住院时间,增加患者负担和细菌耐药性的选择性压力。准确辨别污染能极大减少相应的花费,并有利于降低以后的污染率。但就目前来说,判断血培养污染的金标准并不存在,比如凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)既是最常见的污染菌,也是现在常见的菌血症病原菌之一,其临床意义的判定仍是一个世界性难题,需要临床医生和实验室人员相互沟通,综合分析。血培养污染的鉴别主要依靠以下几个方面:微生物鉴定、阳性检出时间、重复培养结果以及临床特征等[21]
    微生物菌种鉴定对判断血培养污染的价值:当分离出的微生物为金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌以及其他肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、白色假丝酵母菌时,90%以上是血流感染病原菌。分离出化脓性链球菌、无乳链球菌、产单核李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、脆弱拟杆菌、其它假丝酵母菌和新型隐球菌时污染的可能性更低。相反,棒状杆菌、微球菌、气球菌、芽胞杆菌、丙酸杆菌、草绿色链球菌和凝固酶阴性葡萄球菌等很少是菌血症的病原菌。
    血培养阳性瓶数量对判断血培养污染的价值:心内膜炎或血流感染患者所有或大部分血培养瓶为阳性,相反,血培养污染经常只有一瓶为阳性,这是血培养操作指南中推荐血培养至少应一套两瓶(双侧双瓶),最好两套四瓶(双瓶双侧)的一个重要原因。可以用以下公式解释两份以上血培养的临床价值:如果一所医院血培养的污染率为3%,则某患者两个血培养(不同部位采血)均为阳性且污染同一种细菌的可能性为0.09%(3% X 3%)。需要注意的是,有11%的污染菌(尤其是凝固酶阴性葡萄球菌)可重复培养阳性,而病原菌重复培养阳性率为69%(因此多瓶培养可提高阳性率),所以仅用这种方法判定是否为病原菌也存在误差。各实验室应该建立符合本医院现状的鉴别血培养污染的实验室程序,如实、客观地评价本实验室血培养阳性结果的临床价值,并经常回溯性分析根据本程序的判断结果与临床诊疗的一致性,以便不断改进,确保对临床有价值的信息不被丢失。所有菌株尽可能保存几天,一旦从同一个病人后续血培养中分离到相同病原菌并明确其临床意义,则可以进行后续试验。Richter等[22]对从1999.8~2000.4共12374例血培养(多数为成套需氧瓶+厌氧瓶,标本来自外周静脉,用BacT/ALERT全自动血培养系统检测)的结果进行了分析,得出以下血培养污染鉴别规则,以供参考:
从血培养中分离出上述潜在污染菌
    a 48小时内仅有这一瓶血培养,则实验室人员需调取患者资料并与临床医生讨论可能的临床价值:病原菌/污染菌/不能确定。除非临床要求,不做药敏试验。
    b 48小时内还有另一套或另一瓶血培养,但结果为阴性,则作为污染菌通知临床,除非临床要求,不做药敏试验。
    c 48小时内还有另一套或另一瓶血培养,结果为阳性,如果鉴定结果均为草绿色链球菌,则认为是病原菌,做药敏试验并将结果报告临床;如果鉴定结果均为同一种其他潜在污染菌,则其临床意义不能确定,需与临床医生讨论其可能的临床价值:病原菌/污染菌/不能确定。除非临床要求,不做药敏试验。
    鉴别血培养污染的另一个工具是系统阳性报警时间TTD(Time to Detection),前提是病原菌被检测生长的时间要早于污染菌,但实际上两者之间存在交叉,尤其是随着全自动血培养系统的应用,污染菌检测生长时间变短,病原菌与污染菌TTD的差别变得更窄,其鉴别价值也就变得更加模糊。
    近十年来血培养的自动化逐渐普及,一些医院发现血培养污染的比例反而要高于以往,可能的原因是:全自动血培养系统改善了检测微生物生长的算法,从而可以检出以往难以检出的少量细菌生长;象BACTEC 和BacT/Alert系统的培养介质提高了凝固酶阴性葡萄球菌的检出能力,也导致较少的污染菌就能被错误的检出;中央静脉导管等的应用越来越多,从这些部位留取血培养标本也是血培养污染增多的一个重要原因,因为这种方法要彻底消毒相对皮肤消毒要困难得多,虽然临床医护人员认为这种方式能减少患者痛苦和额外的穿刺抽血,实际上一旦发生污染就会导致多次培养、错误诊断、不必要的抗生素治疗等额外的花费和负担。
    总之,目前血培养污染的判断仍缺少独立的金标准,只有通过临床医护人员与实验室的不断沟通,才能一方面减少将污染菌当作病原菌的几率,另一方面也宣传了正确的血培养采集、处理方法,进一步减少了污染发生的可能,形成良性循环,才能最大限度的减少血培养污染的发生及其对临床诊治的干扰。
 
 
附录:
 
 
其他几种特殊要求的血培养
 
 
    1 真菌血培养
    1.1 发生真菌血症的危险因素
    真菌血症检出数量的增加主要是由于血培养技术的提高和医疗方式的改变[25]。酵母菌所致真菌血症主要发生于外伤、胃肠粘膜溃疡、全胃肠外营养、长期使用广谱抗生素或留置静脉导管的患者,以及罹患免疫抑制性疾病的患者。近些年来,在AIDS患者、恶性血液病、骨髓移植和其他实体器官移植以及其他原因导致的严重免疫缺陷的患者,双相真菌(如申克孢子丝菌、球孢子菌、荚膜组织胞浆菌和马尔菲青霉菌)和某些丝状真菌(如镰刀霉、赛多孢属)所致真菌血症有所增多。
    虽然在严重免疫缺陷患者曲霉菌和接合菌(如毛霉菌)的感染比较普遍,但很难从血培养中检出。
    1.2 真菌血症检出的关键因素
    怀疑真菌血症的患者采用需氧血培养瓶采集标本。必要时采用专门的真菌血培养瓶或其他血培养技术。
分离自血培养的最常见的酵母菌包括白色假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌和新型隐球菌,其他假丝酵母菌(如克柔假丝酵母菌、季也蒙假丝酵母菌、葡萄牙假丝酵母菌)和其他酵母菌(如马拉色菌、红酵母菌、毛孢子菌)相对要少得多。
    研究证明,与厌氧瓶相比,酵母菌在需氧瓶中能被更好的分离。培养瓶不断摇动有助于提高酵母菌的检出率。多数酵母菌和酵母样真菌能在孵育的第2至5天被检测到,而一些酵母菌(如光滑假丝酵母菌,新型隐球菌)则需要更长时间的孵育。
    虽然双相真菌可以在多数商业化的需氧血培养瓶中生长,但检测可能需要2至4周的时间。一旦怀疑为双相真菌或丝状真菌感染,需采用裂解-离心技术做血培养[2]
    1.3 真菌感染性心内膜炎诊断
    导致真菌感染性心内膜炎的真菌可能是酵母菌,也可能是丝状真菌,但最常见的还是白色假丝酵母菌及他非白假丝酵母菌,83~95%的真菌性心内膜炎是假丝酵母菌属所致。其发病率越来越高很大程度上被归因于医学的进步,因为其危险因素很多与技术的进步有关,如长期静脉留置导管、全胃肠外营养、使用免疫抑制剂、人造器官(如人工心脏瓣膜、起搏器)植入、长期使用广谱抗生素以及心脏手术等。药物成瘾是真菌性心内膜炎的另一个重要危险因素。
    许多传统手工或自动化血培养系统的培养基可以满足假丝酵母菌的生长需要。但对某些菌株,普通需氧血培养瓶可能结果为阴性,需专门的“真菌血培养瓶”,它们的培养基配方最适合绝大多数酵母菌生长[26]
    2.接受抗菌药物治疗患者的血培养
    患者采血培养时经常接受抗菌药物治疗。抗菌药物对血流感染病原菌检出抑制的可能性需要长期关注。研究结果也证实治疗后血培养的检出率低于治疗前。目前全自动血培养系统的培养瓶通过加入专门的活性炭或树脂颗粒吸附血液标本中的抗菌药物。实验表明这些添加剂吸附或中和不同种类抗生素的能力不同,所需时间也从几小时到几天不等,但总体来看,它们对血流感染病原菌的检出作用相似,效果要好于标准瓶。这类配方能否有效清除血液标本中的抗生素目前还不清楚。不过对某些菌种来说,这类培养瓶检出葡萄球菌、链球菌、肠杆菌科细菌、非发酵菌以及酵母菌的能力更强。但污染菌在这类培养瓶中也更容易生长。
    3.罕见的和苛养病原菌
    一些微生物在血培养中很少被检出,一旦遇到则很可能标明发生了严重感染。例如,从血培养中分离出某种HACEK细菌群是感染性心内膜炎的主要诊断标准之一。以往从血液中分离出这些微生物需要特殊方法,但目前的全自动血培养系统都能有效检测此类苛养菌,并且孵育时间也与普通血培养一样。相对于非苛养菌血培养的阳性报警时间一般在24~36小时以内,苛养菌的阳性报警时间可能较长,有可能到第5天才阳性报警。对于一些微生物,比如军团菌、巴通体、支原体,采用免疫学或分子生物学方法检测更合适。而考克斯体、衣原体、立克次体等则只能用非培养的方法检测。除了巴通体以外,目前实验室常用的自动化血培养系统能够检出绝大多数罕见或苛养菌,包括营养变异链球菌和弗朗西斯菌。
    某些苛养菌导致的血流感染,血培养系统可能阳性报警,但革兰染色镜检未发现微生物。可能原因包括形态不典型或菌体太小等。例如某些营养变异链球菌形态怪异,而弗朗西斯菌菌体细小、常呈多形性且细胞壁薄而致密(未经处理不易着色),支原体也不能被革兰染色。遇到这些情况可以尝试吖啶橙染色[27],比如用吖啶橙染色能在玻片上看到弯曲菌、螺杆菌、布鲁杆菌和巴通体。
    有一点必须注意的是,某些苛养菌,比如弗朗西斯菌和布鲁杆菌,具有很强的感染能力,属人兽共患微生物。必须在生物安全II级(BSL-2)实验室的生物安全柜里进行操作,注意避免发生实验室感染。
    3.1 营养变异链球菌
    现在的全自动血培养系统通常能在孵育的第二天检出这类细菌[28]。需要注意的是,这类细菌的生长需要补充巯醇复合物和VitB6,人血中含有足够的营养成分是营养变异链球菌生长,但转种培养时,培养基中需要补充盐酸-磷酸吡哆醛(0.001%)或L-半胱氨酸(0.05%~0.1%)或两者皆有,可以接种在巧克力培养基或某些厌氧培养基上。在血平板上不生长,但可以将血培养物涂布血平板,然后点种金黄色葡萄球菌,在金黄色葡萄球菌菌落周围有营养变异链球菌卫星样菌落[2]
    3.2 巴通体
    巴通体主要引起猫抓病和杆菌性血管瘤-杆菌性紫癜。血培养能够发现巴通体,但检出率很低,多数情况下需要特殊方法,最好采用裂解-离心技术,然后接种到新鲜配制的巧克力平板上,置于潮湿的CO2培养箱中35℃培养14~28天。由于巴通体导致的血流感染能引起强烈的抗体反应,血清学方法检测更有效[29]。定量PCR技术也已成功应用于临床标本,包括心内膜炎患者的巴通体检测。
    3.3 布鲁杆菌
    布鲁杆菌可通过人体的皮肤、呼吸道、消化道进入人体,进入人体的病菌侵入血液,主要在淋巴结、脾脏、骨髓等处繁殖,以长期发热、多汗、关节痛及全身乏力、疼痛为主要特征,过去多见于牧区,近年来散发于大中城市,发病年龄以青壮年为主。
    以往使用双相瓶分离布鲁杆菌通常需要延长孵育时间。与商品化的双相瓶、裂解-离心血培养技术比较,全自动血培养系统在检出布鲁杆菌方面优势明显,与其他细菌几乎没有什么不同。地区性布鲁杆菌病研究发现大多数菌株能在3天内检出,截止到第7天总检出率达95%,极少数菌株检出时间多于7天[30],而且多数只能从需氧瓶分离出。
    3.4 弯曲菌
    虽然空肠弯曲菌通常与急性胃肠炎有关,但也能导致菌血症、心内膜炎等并能从血培养检出。其他一些罕见的弯曲菌种,如胎儿弯曲菌等,全自动血培养系统一般也能在孵育2~3后检出。空肠弯曲菌在35℃的生长速度较42℃时慢,在转种培养24小时后常看不到明显菌落,在微需氧环境中培养48小时后才可见有菌落生长。
    3.5 弗朗西斯菌
    土拉热弗朗西斯菌是引起土拉热(野兔热)的病原菌,能在标准血培养瓶中生长,但不同变种生长速度不一致,因此系统阳性报警时间也难以预测[31]。某些快速生长的土拉热弗朗西斯菌类似非苛养菌,而另一些菌株则可能需要孵育10天以上。由于其菌体细小和多形性,从阳性报警的血培养瓶中抽取培养液涂片革兰染色时很难发现,并且第一次转种时在羊血培板上可能生长,但继续传代则不能在血平板上生长。某些菌株只能在巧克力培养基上生长。
    3.6 HACEK 细菌群
    从血培养中分离出HACEK 细菌群的细菌,即使缺乏感染等临床特征,也高度提示感染性心内膜炎。HACEK是由5个英文单词的字头组成,H代表除流感嗜血杆菌以外的其它嗜血杆菌属细菌(Haemophilus),A代表放线杆菌属(Actinobacillus),C代表心杆菌属(Cardiobacterium),E代表艾肯菌属(Eikenella),K代表金氏菌属(Kingella)。其共同特征是生长缓慢(需48~72小时才见菌落),生长需要CO2,只有营养丰富的培养基如巧克力平板等才能支持其生长。其血培养检出时间平均为3.4天[32]。对高度怀疑HACEK细菌群细菌导致的心内膜炎,如果孵育5天后仍为阴性,适当延长孵育或终末盲传是有必要的。
    3.7 螺杆菌
    螺杆菌作为菌血症病原菌主要分离自免疫抑制患者,最常见的菌种是同性恋螺杆菌(H.cinaedi)。全自动血培养系统最早能在第三天检出螺杆菌,但常需要5天以上才能报告阳性,因此对疑似此类细菌感染的血培养孵育时间最好延长到7天并终末盲传,转种后需在潮湿的微需氧环境中培养。
    3.8 军团菌
    在很多地区,军团菌是社区获得性肺炎的常见病原菌,但继发的菌血症并不常见。军团菌所致菌血症可发生于肾移植术后,军团菌引起的人工瓣膜心内膜炎也有报道。疑似军团菌所致菌血症患者的血培养孵育时间也是5天,需接种到BCYE培养基。
    3.9 螺旋体和支原体
    虽然已经有关于从血液中检出螺旋菌的报道,但从血培养中检出螺旋菌还不太可能。对疑似螺旋菌所致菌血症的诊断需依靠其他方法。当前血培养系统还不能可靠地从血培养中检出支原体。偶尔能检出人形支原体,但需特殊的添加剂如凝胶、精氨酸等。(整理夏修三)


 
 
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